KRAS

KRAS – онкоген, кодирующий один из белков, которые играют важнейшую роль в системе рецептора эпидермального фактора роста (РЭФР) – сложнейшего сигнального каскада, принимающего непосредственно участие в прогрессировании КРР. Этот ген был назван в честь Werner H.Kirsten – доктора, руководителя отдела патологии в медицинском центре в Чикаго. Впервые он описал этот ген при саркомах крыс. Белок KRAS регулирует белки, которые находятся в сигнальной системе РЭФР, связанные с выживаемостью опухоли, пролиферацией, ангиогенезом и метастазированием. Этот белок считается ключевым компонентом системы РЭФР, так как именно он передает сигналы с РЭФР к механизму транскрипции в ядре.

Обычно гены-супрессоры и онкогены KRAS работают вместе, регулируя нормальное деление клеток. Если онкогены KRAS отвечают за включение процесса роста клеток, то гены-супрессоры – за выключение этих процессов. Но когда онкоген подвергается мутации, он провоцирует быстрое деление клеток, приводящее к образованию опухоли. Если же результат мутации гена-супрессора сравним с поломкой тормоза в машине, то мутацию онкогена сравнивают с педалью газа, вжатой в пол. Он заставляет делиться клетки без конца, и процесс деления все ускоряется и ускоряется.

Находят в опухолях три типа онкогена KRAS. Кодируют или мутированный белок (аномальный), известный как мутантный тип KRAS, или немутированный белок («нормальный»), известный как дикий тип. Такой «статус» белка KRAS указывает на прогноз и несет предиктивную информацию в отношении ответа на применение анти-РЭФР терапии.

В опухолях с диким типом система РЭФР функционирует нормально, и активируется белок KRAS только на некоторое время в ответ на стимуляцию, такую как активацию сигнальной системы РЭФР. В свою очередь в опухолях с мутированным геном белок KRAS находится постоянно во «включенном» состоянии независимо от активации системы РЭФР. В результате этого эффекты, которые ведут к росту опухоли и ее дальнейшему распространению, не регулируются.

При КРР около 60% пациентов имеют дикий тип онкогена KRAS и нормальную систему РЭФР, остальные же 40% – мутантный тип онкогена. Как правило, (в 90% случаях) мутация KRAS происходит в 12 и 13 генных кодонах, кодирующих остатки домена белка KRAS, который связывает гуанин нуклеотид. Такая мутация стабилизирует в активном состоянии KRAS, в соединении с ГТФ, благодаря снижению активности собственной ГТФ активности белка. Гораздо реже описываются мутации в следующих кодонах: 146, 63, 61 и 59.

KRAS – представитель семейства RAS, мелких белков, которые связывают гуанозиновые нуклеотиды. К ним также относятся NRAS и НRAS. Указанные белки крепятся к цитоплазматической стороне мембраны с помощью липидных остатков на С-терминальной части. Ген KRAS является молекулярным переключателем, следовательно, как и для других белков RAS, основная функция KRAS заключается в самом переходе из неактивного ГДФ состояния в активное, в котором белок высвобождает ГДФ, связывая при этом ГТФ в той же зоне. Включение или активация KRAS наступает после димеризации РЭФР и прикрепления ЭФР к РЭФР, что приводит к аутофосфорилированию и синтезу целого ряда адаптивных белков и продуктов обмена гуанина. Затем активированный KRAS через ряд сложнейших внутриклеточных каскадов, включающих систему RAF-1-MEK-MAPK, передает сигналы роста. В физиологическом нормальном сигнальном процессе KRAS выключается самостоятельно благодаря ГТФ-азе, которая гидролизирует связанный ГТФ до ГДФ, тем самым возвращая белок в неактивное состояние.

Практически все злокачественные опухоли развиваются из-за мутации онкогена KRAS. Внешние факторы не вызывают образование КРР, а лишь запускают мутации, приводящие к его появлению. Говоря иными словами, если ген KRAS можно сравнить с обычной лампочкой, которую вы можете включить, а внешние факторы – ни что иное, как выключатель, при нажатии на который включаются этот ген. Но даже в случае, если вы вдруг унаследовали «плохие» гены, можно уменьшить риск заболевания, ведя здоровый образ жизни и регулярно проходя обследование. Таким образом, нужно понимать ваши факторы риска КРР – те условия, которые понижают или повышают вероятность заболевания.

Анализ KRAS показывает, является ли он нормальным, или в его структуре имеются генетические отклонения. Этот анализ выполняется в генетической лаборатории. Для его проведения нужен образец ткани, получаемый при помощи биопсии.

Трактовка результатов анализа KRAS

• генетически нормальный профиль KRAS является основным показанием для проведения лечения, подавляющего гиперактивность РЭФР.
• мутации (изменения) KRAS свидетельствуют о невозможности лечения.

Биологическое лечение – высокоэффективный метод, способный на раннем этапе развития опухоли привести к полному и быстрому выздоровлению больного. Но применение данного метода обусловлено целым рядом генетических факторов.

Важно! Такая проверка на онкоген KRAS дает возможность точно и быстро выбрать оптимальный способ лечения. Во-первых, она дает возможность не тратить время (столь драгоценное для больного) на попытки неадекватного лечения. Во-вторых, будучи применено правильно, такое лечение позволяет избежать травматичных для организма способов лечения: химиотерапии и хирургии с их тяжелыми побочными явлениями. Таким образом, анализ является одним из современных, передовых методов выбора тактики лечения колоректального рака.

В лабораториях разработан тест на мутации 13 и 12 кодонов KRAS в режиме реального времени в формате ПЦР. Чувствительность этого теста позволяет определить наличие 5% мутантной ДНК в опухоли, что гораздо выше чувствительности секвенирования ДНК. Для генетического исследования применяется биопсийный или операционный материал, а также «архивные блоки», то есть залитые в парафин ткани.

В качестве источника ткани может использоваться как метастаз, так и первичное новообразование. Время забора биопсийного материала не имеет значения: операционный материал, который взят на этапе диагностики, биопсийный материал и ткань, полученные из метастазов, пригодны для анализа.

Допустимо запрашивать из специального патоморфологического архива лекарственные препараты, произведенные несколько лет назад.

Материалом для определения мутаций в гене KRAS может быть:

• свежезамороженная опухолевая ткань;
• блок ткани опухоли, который фиксирован формалином и заключен в парафин;
• срезы в парафине опухолевой ткани.

Содержание опухолевых клеток:

Для корректного анализа мутаций онкогена KRAS ткань должна содержать более 10% опухолевых клеток. Так как для определения отсутствия или наличия мутации онкогена KRAS важно выделить врачом достаточное количество ДНК, одним из основных критериев пригодности материала считается большое содержание клеток опухоли.

Для того чтобы результаты теста адекватно отражали отсутствие/наличие в опухоли генетических изменений содержание в препарате опухолевых клеток должно быть:

• минимально – 20%;
• оптимально – 50%;
• в других случаях следует провести микро- или макродиссекцию (изоляцию отдельных клеток с нужными характеристиками).

Наличие специального гистологического препарата, который получен из среза опухоли в комплекте с «парафиновым блоком» значительно упрощает процедуру выделения клеток для генетического анализа.

Условия фиксации ткани.

Еще один фактор, который оказывает решающее влияние на достоверность и точность результата исследования – это, конечно же, условия обработки, которую претерпел материал перед тем, как из него выделили ДНК. Фиксация ткани формалином – процедура, обеспечивающая сохранность биологического материала, хотя, взаимодействуя с нуклеиновыми кислотами (РНК, ДНК), формалин стимулирует их разрушение, делая их непригодными для генетических манипуляций.

Последние достижения в понимании механизмов образования злокачественных опухолей способствовали разработке более эффективных препаратов и методов лечения КРР. Теперь стало совершенно понятно, что опухоли, возникающие в одном и том же внутреннем органе, могут быть разными на молекулярно-генетическом уровне. Выявление таких особенностей каждой опухоли является ключом к верному лечению.

Применяемая система анализа ДНК для определения мутаций KRAS, BRAF, РЭФР позволяет выявить 1% мутантных онкогенов при 99% совершенно нормальной ДНК. Основана эта технология на применении зондов в режиме реального времени в формате ПЦР. Метод помогает врачам в выявлении опухолей, которые содержат мутантные гены, для выбора правильного лекарственного препарата для лечения.

На сегодняшний день существует два типа препаратов – ингибиторов рецепторов эпидермального ростового фактора, применяющихся в таргетной терапии опухолей:

• анти-РЭФР антитела (Вектибикс и Эрбитукс);
• ингибиторы ТК РЭФР (препараты Тарцева и Иресса).

Эффективность лечения данным препаратами зависит от наличия мутаций в KRAS, статуса РЭФР и прочих факторов.

При отсутствии мутации в онкогене KRAS эффективность лечения КРР очень высока. В случае же наличия мутаций в онкогене KRAS в опухолевых клетках больного, использование Вектибикса или Эрбитукса не приводит к позитивным результатам. В 30-40% случаях выявляются мутации 13 или 12 кодонов KRAS, коррелирующих с резистентностью опухолей к лечению препаратами Вектибиксом или Эрбитуксом. В связи с этим Европейское Медицинское Агентство и Американское Общество Онкологов рекомендует использование препаратов Вектибикс и Эрбитукс только для лечения опухолей, которые содержащих онкоген KRAS дикого типа (то есть без мутаций).

Результаты многочисленных исследований подтвердили клиническую эффективность вышеперечисленных препаратов:

• препараты – ингибиторы РЭФР улучшают эффективность лечения мутантного КРР в сочетании с существующими на сегодняшний день схемами медикаментозной терапии данной патологии; для пациентов с метастатическим поражением органов данное утверждение имеет большое значение в плане возможности хирургического вмешательства и улучшения прогноза;
• препараты – ингибиторы РЭФР открывает большие перспективы для большинства больных мутантным КРР в плане получения длительной стабилизации опухолевого процесса;
• хорошая переносимость препаратов и возможность контроля их побочных эффектов (кожных реакций и диареи) доказаны в многочисленных клинических исследованиях;
• прогностическим фактором эффективности препаратов являются именно онкоген KRAS и некоторые виды белков, изучение которых до сих пор продолжается.

Необходимость проведения теста на наличие мутаций перед применением препаратов указана в руководствах по применению этих лекарственных препаратов. Но тест статуса онкогена KRAS пока не указан в руководствах к препаратам Тарцева и Иресса, связь резистентности НМРЛ с мутациями KRAS к этим препаратам была выявлена при исследованиях на пациентах азиатских и европейских этнических групп, включая больных с мутациями одновременно РЭФР и KRAS.

Тест на мутации онкогена KRAS необходим больным КРР для оценки возможности лечения препаратами Вектибикс или Эрбитукс. Также рекомендуется пройти тест KRAS больным КРР для оценки возможности терапии лекарственными препаратами Тарцева или Иресса.

Наличие активирующих мутаций онкогена KRAS в опухолях является главным противопоказанием к применению лекарственным препаратов – ингибиторов РЭФР (Тарцева, Эрбитукса, Иресса, Вектибикса).

Любая из шести мутаций двенадцатого кодона (gly12asp, gly12ala, gly12arg, gly12val, gly12ser, gly12cys) и одна мутация тринадцатого кодона (gly13asp) коррелируют с резистентностью опухолей РТПК и НМРЛ к лечению препаратами Тарцева, Эрбитукса, Иресса или Вектибикса.

Согласно проведенным исследованиям было установлено, что существует большая разница в реакции на лечение на рецепторы РЭФР между опухолями без мутации и опухолями, клетки которых несут мутации в KRAS. Проверка наличия мутации в онкогене KRAS помогает в решении, есть ли место для лекарственных препаратов, ингибиторов РЭФР, в случаях колоректального рака, после неудачи химиотерапии. Так. Например, опубликованное в 2008 году исследование, в журнале под названием Clinical Journal of Oncology, еще раз доказало, что применение препарата Эрбитукс, при наличии мутации в онкогене KRAS, является неэффективным. Это является прогностическим показателем. В то же время лечение будет эффективным для больных колоректальным раком, с мутацией в РЭФР, но без мутации в онкогене KRAS.

Проведенные исследования

Исследование №1

В настоящее время пациенты с колоректальным раком сразу после постановки врачом диагноза могут пройти специальный тест, определяющий статус онкогена KRAS. Это позволяет врачам выбрать оптимальное лечение и улучшить отдаленные результаты. У больных с диким типом онкогена KRAS при применении анти-РЭФР терапии может наблюдаться в первой линии лечения частота ответа 59% и снижение прогрессирования на 40%.

Такой факт имеет важное значение, так как во многих исследованиях была продемонстрирована целесообразность достижения высочайших показателей частоты ответа, потому как последняя коррелирует с большой вероятностью излечения и частотой резекции, в частности:

В рандомизированном исследовании третьей фазы медиана ОВ в популяции больных, имеющих дикий тип онкогена KRAS и получающих Эрбитукс, а также химиотерапию FOLFIRI, составила 23 месяца по сравнению с 20 месяцев у пациентов, получающих только химиотерапию (p=0,0094; КР=0,796). Также в исследовании CRYSTAL было доказано снижение риска прогрессирования этого заболевания на 30 % при добавлении Эрбитукса к химиотерапии (p=0,0012; КР=0,696).

Наблюдалось существенное увеличение ЧО до 58 % в группе, где применялась комбинация Эрбитукс и химиотерапии по сравнению с 40 % при использовании лишь химиотерапии (p<0,0001).

В рандомизированном исследовании второй фазы медиана ОВ составила 22 месяцев у пациентов, имеющих дикий тип онкогена KRAS и получающих лечение Эрбитуксом в комбинации с химиотерапией, по сравнению с 18 месяцами у пациентов, получающих только химиотерапию (p=0,3854; КР=0,855).

Кроме этого, при данном исследовании врачи наблюдали снижение риска прогрессирования КРР на 43,4% (p=0,0064;КР=0,567) у пациентов, получающих Эрбитукс вместе с химиотерапией, по сравнению с самой только химиотерапией в популяции пациентов, имеющих дикий тип онкогена KRAS.

Также в исследовании было продемонстрировано увеличение частоты ответа на 67 % в группе применения препарата Эрбитукс и химиотерапии FOLFOX по сравнению с самой только химиотерапией у пациентов, имеющих дикий тип онкогена KRAS (ЧО – 57 % в противовес 34 %, p=0,0027).

Все эти данные говорят о высокой эффективности Эрбитукса при добавлении его к химиотерапии в первой линии лечения КРР у пациентов, имеющих дикий тип онкогена KRAS, по сравнению с самой только химиотерапией.

Исследование № 2

Мутации онкоогена KRAS выявляют в 40 % случаев КРР. На сегодняшний день уже было описано свыше трех тысяч точечных мутаций гена в опухолевых клетках. Приблизительно 17% и 82% всех мутаций онкогена KRAS обнаруживают в кодонах 13 и 12 соответственно. Только 3% пациентов с наличием мутации онкогена KRAS в клетках опухоли отвечают на лечение анти-РЭФР, в то время как у больных, опухоли которых экспрессируют дикий тип онкогена, такой показатель достигает 33%. Поэтому определение статуса онкогена KRAS является ключевым моментом в прогнозе ответа на терапию цетуксимабом и панитумумабом. Врачи рекомендуют использование анти-РЭФР для лечения КРР исключительно пациентам без мутации онкогена KRAS.

Цель исследования – определение частоты, а также спектра мутаций онкогена KRAS у людей, больных КРР.

Объектом исследования были сто тридцать девять образцов опухолевой ткани больных КРР. В данное исследование, для исключения ошибки отбора, включили всех пациентов, направленных на тестирование статуса гена KRAS. Среди пациентов было 104 женщины и 35 мужчин, средний возраст которых составил 63 года.

Врачи исследовали опухолевую ткань, которая была получена от пациентов при проведении хирургического вмешательства, фиксированную формалином и закрытую парафиновыми блоками. Затем парафиновые блоки нарезали с целью получения 3–6-серийных срезов толщиной 7 мкм и далее фиксировали на стеклах. Для патогистологической оценки и выявления зон локализации клеток опухоли один из срезов был окрашен гематоксилин-эозином. После депарафинизации в ксилоле осуществляли макро- или микродиссекцию 2–4-х срезов ткани с целью получения суспензии клеток, которая содержит не менее 72% опухолевых. ДНК выделяли при помощи наборов Nucleospin Tissue DNA Mini-Kit и QIAamp DNA minikit в строгом соответствии с рекомендациями данных немецких производителей. Статус онкогена KRAS изучали амплификацией мутантной последовательности ДНК вместе с супрессором нормальной аллели с маркировкой продукта цепной полимеразной реакции биотином c дальнейшей избирательной гибридизацией биотинилированного продукта на пробы стрип-теста (ViennaLab, KRAS StripAssay, Австрия) в строгом соответствии с рекомендациями производителя. Данный метод позволил определить мутации, которые локализированы в 12-м (р.Gly12Arg, р.Gly12Val, р.Gly12Leu, р.Gly12Ile, р.Gly12Asp, р.Gly12Ala, р.Gly12Cys, р.Gly12Ser) и 13-м (р.Gly13Cys, р.Gly13Asp) кодонах второго экзона гена KRAS.

При помощи программного пакета под названием Statistica 5.5 (США) были проведены статистические расчеты. Данные оценивали с применением критерия Фишера в 2-х стороннем варианте. При р<0,05 разница между показателями оценивалась как значимая.

Результаты

Из ста тридцати девяти образцов опухоли статус онкогена KRAS (мутационный) удалось выявить в ста тридцати одном случае. В восьми случаях трехкратные попытки амплификации ДНК были безуспешны, что обусловлено с наибольшей вероятностью химической модификацией и деградацией ДНК опухолевых клеток во время гистологической проводки. Из сто тридцать одного случая, в которых выявление мутационного статуса онкогена KRAS оказалось возможным, наличие мутаций в 13-м и 12-м кодонах онкогена определено в 56 (примерно 43 %). В спектре уже определенных мутаций самой частой (36%, 20 из 56 пациентов с мутацией) оказалась замена в 12-м кодоне (р.Gly12Asp) глицина на аспартат. Затем, по частоте представления, расположились мутации таким образом: р.Gly12Val – 30,5% (17 из 56 пациентов с мутацией), р.Gly13Asp – 10,6% (6 из 56 пациентов), р.Gly12Ser — 8,8% (5 из 56 пациентов), р.Gly12Cys – 7,2% (4 из 56 пациентов), р.Gly12Ala – 5,3% (3 из 56 пациентов), р.Gly12Arg – 1,8% (1 из 56 пациентов). Также стоит отметить, что не были представлены (ни в одном из случаев) две или более мутаций одновременно.

Обсуждение

Таким образом, мутационный статус онкогена KRAS был определен у 139 больных КРР. Так как по данным опубликованных работ, 98–99% мутаций онкогена KRAS приходится на 12-й и 13-й кодоны, и только 2% мутаций – в 146-м и 61-м кодонах, мы ограничились исследованием самых частых аномалий. Мутации онкогена KRAS были обнаружены в образцах у 56 из 131 больного (42,7%). Полученные данные полностью соответствуют другим результатам генотипирования, согласно которым частота мутаций онкогена KRAS находится в диапазоне 36–44%.

По результатам проведенного исследования лидирующие позиции в спектре мутаций занимают р.Gly12Asp, р.Gly12Val, р.Gly13Asp. Хотя соотношения частот мутаций, по данным разных авторов, немного отличаются между собой, хотя особо значимых различий как по спектру между данными, так и по их частоте нет.

В исследовании была выявлена связь между частотой мутаций в гене KRAS и полом больных КРР. Оказалось, что среди женщин уровень распространенности мутации онкогена KRAS выше, чем среди больных мужского пола (49%, 47 из 98 пациентов против 27 %, 10 из 33 пациентов соответственно). Все полученные результаты были полностью сопоставимы с данными Hong Shen исследования и его соавторов, которые определили мутации онкогена KRAS у женщин и мужчин, больных КРР, на уровне 44,6 и 28,3%. Однако, так как в крупном исследовании, которое включало 2721 пациента, не было установлено зависимости пола от частоты мутации онкогена, выявленные тенденции нужно проверить на большем объеме выборки.

Полученные результаты исследования говорят о распространенности мутаций KRAS при КРР и подтверждают, что их спектр и частота в популяции больных КРР нашей страны никоим образом не отличаются от таковых среди больных этим заболеванием Китая и Западной Европы. Таки образом, определение статуса онкогена KRAS является ключевым моментом в прогнозировании ответа на терапию анти-РЭФР.

Выводы

1. Данные о спектре и частоте мутаций онкогена KRAS у больных КРР в нашей стране не отличаются от других результатов генотипирования, полученных при исследованиях других зарубежных авторов.
2. Мутации онкогена KRAS в нашей стране встречаются реже у мужчин, чем у женщин.
3. В связи с непригодностью парафиновых блоков для исследований мутационного статуса онкогена рекомендовано соблюдать условия (при гистологической проводке образцов), дающие возможность проведения генетических тестов.
4. Рекомендовано использование препаратов-ингибиторов РЭФР для лечения опухолей, которые содержащих онкоген KRAS дикого типа. Их хорошая переносимость, а также возможность контроля их побочных эффектов (кожных реакций и диареи) доказана в клинических исследованиях.