Секвенирование NGS

NGS, или next generation sequencing, — секвенирование нового поколения. Термин означает определение нуклеотидной последовательности (исследование первичной структуры) ДНК или РНК. Секвенировать можно и другие биополимерные молекулы, например белки, но в этой статье речь пойдет только о нуклеиновых кислотах.

В настоящее время применяется несколько вариантов метода. Один из наиболее распространенных — секвенирование по Сэнгеру. Преимуществом является высокая точность и относительно низкая стоимость при исследовании небольших фрагментов ДНК. Недостатком является низкая пропускная способность и дороговизна при исследовании большого объема данных. Именно эти минусы стали основой для разработки и внедрения более современной технологии — NGS.

Особенности NGS

Необходимость разработки NGS была обусловлена стремлением к автоматизации анализа, увеличению объема получаемой информации и снижению стоимости исследования. Принцип технологии NGS основан на массовом одновременном секвенировании тысяч фрагментов ДНК на базе подготовленных однонитевых библиотек. Методика включает три этапа:

• подготовка библиотек;
• сиквенс;
• анализ полученных данных.

Преимущества NGS:

• снижение стоимости исследования;
• автоматизация анализа;
• большой объем получаемой информации.

Методы NGS имеют большую производительность, позволяют выполнять одновременное считывание миллиардов коротких фрагментов нуклеиновых кислот. Кроме того, NGS дает возможность проводить секвенирование сразу нескольких десятков геномов за один запуск анализатора.

Виды NGS

Технология секвенирования следующего поколения может быть реализована на основе следующих методов:

1. Пиросеквенирование — основано на регистрации пирофосфата, образующегося при мобилизации очередного нуклеотида на матрицу ДНК. Регистрация пирофосфата производится посредством каскада химических реакций, в конце которого выделяется квант света.
2. Секвенирование на молекулярных кластерах также происходит на базе синтеза новой молекулы ДНК на основании матрицы. Она крепится на поверхности проточной ячейки, а детекция осуществляется посредством флуоресцентной метки нуклеотидов.
3. Техническое лигазное секвенирование в отличие от предыдущих методов использует образование химических связей между нуклеотидами посредством лигазы. Клональная библиотека наносится на магнитные сферы и помещается в проточную ячейку. Последовательность нуклеотидов определяется с помощью отщепляющейся флуоресцентной метки.
4. Ионное полупроводниковое секвенирование основано на использовании полупроводниковых микрочипов. В момент удлинения синтезируемой цепи на один нуклеотид происходит изменение рН на микрочипе. Оно регистрируется, и таким образом определяется последовательность нуклеотидов.
5. Одномолекулярное секвенирование относится к методам третьего поколения. Оно позволило отказаться от полимеразной цепной реакции на этапе пробоподготовки и дает возможность следить за наращиванием синтезируемой цепи в режиме реального времени.

Области применения NGS

• Секвенирование генома de novo — расшифровка ранее неизученного генома. Используется в бактериологии, вирусологии и др.
• Полногеномное ресеквенирование.
• Направленное ресеквенирование генов, про которые известно, что наличие в них мутации приводит к развитию заболевания.
• Секвенирование РНК — проводится для оценки экспрессии генов. При этом можно оценивать как кодирующие, так и регуляторные РНК.
• Метагеномное секвенирование — позволяет определить состав организмов в исследуемом образце, например, в материале, взятом из кишечника или ротовой полости.

В медико-генетическом центре «Геномед» имеется современное оборудование и квалифицированный персонал для проведения секвенирования методом NGS.