Мониторинг МОБ солидной опухоли и ранняя диагностика рецидива

Мониторинг минимальной остаточной болезни (МОБ) солидной опухоли и ранняя диагностика прогрессирования заболевания, что могут предложить генетики?

Неопределенность в принятии решений является частой проблемой ведения онкологических пациентов. Диагностика МОБ и раннего прогрессирования злокачественного новообразования является сложно выполнимой задачей при использовании традиционных методов диагностической визуализации или при мониторинге сывороточных онкомаркеров. Даже после тщательной оценки результатов проведенных исследований, оценки клинико-патоморфологических факторов и обсуждения потенциальных рисков - выбор тактики ведения пациента не всегда ясен.

Что такое свободно циркулирующая ДНК?

Свободно циркулирующая, внеклеточная ДНК (сцДНК) определяется в основном в плазме крови, но также может быть обнаружена в различных жидкостях организма, включая мочу [1-6], спинномозговую [7-9], плевральную [10-12], асцитическую жидкость [13] и слюну [14,15]. сцДНК попадает в кровоток путем клеточного апоптоза, некроза и активной секреции. У здоровых людей большая часть сцДНК происходит из гемопоэтических клеток, эритроцитов, лейкоцитов и эндотелиальных клеток [16,17]. Этими же способами в кровоток попадет ДНК из опухолевых клеток, несущая драйверные и пассажирские мутации. Таким образом в плазме крови пациентов со злокачественным новообразованием циркулирует нормальная ДНК из здоровых клеток и небольшое количество опухолевой ДНК.

Характеристики сцДНК:

1) фрагменты двухцепочечной ДНК длиной от 150 до 200 пар оснований [18].

2) сцДНК имеет короткий период полураспада в диапазоне от 16 минут до 2,5 часов [19,20].

3) Для сохранение сцДНК рекомендован забор крови в специальные пробирки для сбора крови с консервантом, стабилизирующим ядросодержащие клетки.

С распространением технологии секвенирования следующего поколения (NGS) возобновился интерес к изучению сцДНК как инструмента, позволяющего выявлять минимальную остаточную болезнь и ранний рецидив опухоли.

SignateraTM - это первый анализ сцДНК, который был специально разработан для обнаружения МОБ и мониторинга ответа на лечение, позволяя определять циркулирующую опухолевую ДНК (цоДНК) с частотой < 0.1% от общей сцДНК плазмы [21-25].

Подход Signatera

Рутинные методы обнаружения сцДНК обычно включают анализ частых мутаций в генах, ассоциированных с терапией и прогнозом заболевания. Обычно исследования даже в рамках панелей генов обнаруживают лишь одну или две драйверные мутации в цоДНК. Кроме того, предел обнаружения мутантного аллеля обычно не выше 0.1-1% [26-33].

За счет чего достигается высокая аналитическая чувствительность и специфичность Signatera?

• 8-ми летний опыт работы со сцДНК при выполнении неинвазивных пренатальных ДНК тестов для более чем 60 000 беременных женщин.
• Оптимизированный метод выделения сцДНК и подготовки библиотек.
• Предварительный поиск конкретных мутаций присутствующих в опухолевой ткани.
• Сверхглубокое секвенирование (100 000x) каждой мутации в сцДНК плазмы.

Исследование включает в себя несколько этапов:

Аналитическая чувствительность теста Signatera

Валидация аналитической методики.

Клеточные линии: аналитическую валидацию для анализа Signatera проводили на двух клеточных линиях рака молочной железы (HCC2218, HCC1395), и клеточной линии рака легких (NCI – H1395) и соответствующих им нормальных аналогах (HCC2218 – BL, HCC1395 – BL и NCI – H1395 – BL). Титрование ДНК: различные количества опухолевой ДНК (концентрации 0%, 0,005%, 0,01%, 0,03%, 0,05%, 0,1%, 0,3%, 0,5% и 1%) титровали в соответствующуюнормальную ДНК, полученную из клеточных линий.

Конструкция праймера: пул праймеров для мультиплексной ПЦР (мПЦР) (каждый состоящий из 16 пар праймеров, специфичных для клональных соматических мутаций), был разработан с учетом данных, полученных путем секвенирования ДНК клеточных линии опухоли и ДНК нормальных клеточных линий. Начальный общий вклад в подготовку библиотеки для каждой реакции составлял 15 000–20 000 эквивалентов гаплоидного генома. Однонуклеотидные варианты от соответствующей пробы опухолевой ДНК были амплифицированы с использованием праймеров для анализа 16-плексной ПЦР. Продукты мПЦР были баркодированы, и объединены с другими баркодироваными продуктами мПЦР, а затем секвенированы на секвенаторе IlluminaHiSeq 2500со средней глубиной прочтения ~ 100000x на 1 из 16 мутаций.

Обнаружение цоДНК после операции и после адъювантной химиотерапии связано с более высоким риском рецидива. Молекулярный рецидив обнаруживается в среднем за 8,7 месяца до клинического рецидива.

Рисунок 1. Безрецидивная выживаемость пациентов с колоректальным раком в зависимости от обнаружения цоДНК.

 

Исследование Signatera валидировано и может быть рекомендовано пациентам с 4 типами злокачественных новообразований: немелкоклеточный рак легкого, мышечно-инвазивный рак мочевого пузыря, колоректальный рак, рак молочной железы. Также исследование может быть рекомендовано пациентам с другими солидными опухолями, после предтестового консультирования врачом генетиком и врачом онкологом.

Интерпретация результатов исследования:

1. Результат отрицательный
   • 
   • После хирургического лечения: низкий риск рецидива, возможность отказа от адьювантной химиотерапии.
2. Результат положительный
   • 
   • После хирургического лечения: высокий риск рецидива, адьювантная химиотерапия показана.
   • При мониторинге лечения:

     - при повышении уровня цоДНК - высокий риск рецидива, рекомендовано увеличение частоты визуализационных исследований.
     - при снижении уровня цоДНК –вероятно выбрана удачная тактики лечения.

   • После адьювантной химиотерапии без клинических признаков рецидива: >98% риск клинического рецидива без дополнительного лечения.

*Исследование Signateraвыполняется лабораторией Геномед в сотрудничестве с лабораторией Natera (Сан-Карлос, США).

Список литературы:

1. Botezatu I., Serdyuk O., Potapova G., et al. Genetic analysis of DNA excreted in urine: a new approach for detecting specific genomic DNA sequences from cells dying in an organism. Clin Chem. 2000;46:1078–84.
2. Chan K.C.A., Leung S.F., Yeung S.W., et al. Quantitative analysis of the transrenal excretion of circulating EBV DNA in nasopharyngeal carcinoma patients. Clin. Cancer Res. 2008;14:4809–13.
3. Burnham P., Dadhania D., Heyang M., et al. Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract. Nat Commun. 2018;9:1–10.
4. Dudley J.C., Schroers-Martin J., Lazzareschi D.V., et al. Detection and surveillance of bladder cancer using urine tumor DNA. Cancer Discov. 2018. 10.1158/2159-8290.CD-18-0825.
5. Springer S.U., Chen C-H., Rodriguez Pena M.D.C, et al. Non-invasive detection of urothelial cancer through the analysis of driver gene mutations and aneuploidy. Elife. 2018;7:1–27.Google Scholar
6. Lu T., Li J. Clinical applications of urinary cell-free DNA in cancer: current insights and promising future. Am J Cancer Res. 2017;7:2318–32.
7. Wang Y., Springer S., Zhang M., et al. Detection of tumor-derived DNA in cerebrospinal fluid of patients with primary tumors of the brain and spinal cord. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:9704–9.
8. Pan W., Gu W., Nagpal S., et al. Brain tumor mutations detected in cerebral spinal fluid. Clin. Chem. 2015;61:514–22
9. De Mattos-Arruda L., Mayor R., Ng C.K.Y., et al. Cerebrospinal fluid-derived circulating tumour DNA better represents the genomic alterations of brain tumours than plasma. Nat Commun. 2015;6:1–6.Google Scholar
10. Sriram K.B., Relan V., Clarke B.E., et al. Pleural fluid cell-free DNA integrity index to identify cytologically negative malignant pleural effusions including mesotheliomas. BMC Cancer. 2012;12:1–12.
11. Soh J., Toyooka S., Aoe K., et al. Usefulness of EGFR mutation screening in pleural fluid to predict the clinical outcome of gefitinib treated patients with lung cancer. Int J Cancer. 2006;119:2353–8.
12. Husain H., Nykin D., Bui N., et al. Cell-free DNA from ascites and pleural effusions: molecular insights into genomic aberrations and disease biology. Mol Cancer Ther. 2017;16:948–55.
13. Husain H., Nykin D., Bui N., et al. Cell-free DNA from ascites and pleural effusions: molecular insights into genomic aberrations and disease biology. Mol Cancer Ther. 2017;16:948–55. 14. Mithani SK, Smith IM, Zhou S, et al. Mitochondrial resequencing arrays detect tumor-specific mutations in salivary rinses of patients with head and neck cancer. Clin Cancer Res. 2007;13:7335–40.
14. Wei F., Lin C-C., Joon A., et al. Noninvasive saliva-based EGFR gene mutation detection in patients with lung cancer. Am J Respir Crit Care Med. 2014;190:1117–26.
15. Lui Y.Y.N., Chik K.W., Chiu R.W.K., et al. Predominant hematopoietic origin of cell-free DNA in plasma and serum after sex-mismatched bone marrow transplantation. Clin Chem. 2002;48:421–7
16. Snyder M.W., Kircher M., Hill A.J., et al. Cell-free DNA comprises an in vivo nucleosome footprint that informs its tissues-of-origin. Cell. 2016;164:57–68. 
17. Corcoran R.B., Chabner B.A. Application of cell-free DNA analysis to cancer treatment. N Engl J Med. 2018;379:1754–65.
18. Lo Y.M., Zhang J., Leung T.N., et al. Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma. Am J Hum Genet. 1999;64:218–24.
19. Yao W., Mei C., Nan X., et al. Evaluation and comparison of in vitro degradation kinetics of DNA in serum, urine and saliva: a qualitative study. Gene. 2016;590:142–8.
20. Abbosh C., Birkbak N.J., Wilson G.A., et al. Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution. Nature. 2017;545(7655):446-451.
21. Sethi H., Salari R., Navarro S., et al. Analytical validation of the Signatera™ RUO assay, a highly sensitive patient-specific multiplex PCRNGS-based noninvasive cancer recurrence detection and therapy monitoring assay. In: Proceedings from the American Association for Cancer Research Annual Meeting; April 17, 2018; Chicago, IL. Abstract 4542.
22. Reinert T., Henriksen T.V., Rasmussen M.H., et al. Serial circulating tumor DNA analysis for detection of residual disease, assessment of adjuvanttherapy efficacy and for early recurrence detection in colorectal cancer. Posterpresentedat: ESMO 2018 Congress; October 19-23, 2018; Munich, Germany. Abstract 5433.
23. Birkenkamp-Demtröder K., Christensen E., Sethi H., et al. Sequencing of plasma cfDNA from patients with locally advanced bladder cancer forsurveillance and therapeutic efficacy monitoring. Poster presented at: ESMO 2018 Congress; October 19-23, 2018; Munich, Germany. Abstract5964
24. Coombes R.C., Armstrong A., Ahmed S., et al. Early detection of residual breast cancer through a robust, scalable and personalized analysis ofcirculating tumour DNA (ctDNA) antedates overt metastatic recurrence. Poster presented at: San Antonio Breast Cancer Symposium; December 4-8, 2018; San Antonio, TX. Abstract 1266.
25. Reiman A., Kikuchi H., Scocchia D., et al. Validation of an NGS mutation detection panel for melanoma. BMC Cancer. 2017;17:150.
26. Simen B.B., Yin L., Goswami C.P., et al. Validation of a next-generation-sequencing cancer panel for use in the clinical laboratory. Arch Pathol Lab Med. 2015;139(4):508-517.
27. Singh R.R., Patel K.P., Routbort M.J., et al. Clinical massively parallel next-generation sequencing analysis of 409 cancer-related genes for mutations and copy number variations in solid tumours. Br J Cancer. 2014;111(10):2014-2023.
28. Domínguez-Vigil I.G., Moreno-Martínez A.K., Wang J.Y., Roehrl M.H.A., Barrera-Saldaña H.A. The dawn of the liquid biopsy in the fight against cancer. Oncotarget. 2018;9:2912-2922. doi: 10.18632/oncotarget.23131.
29. Lanman R.B., Mortimer S.A., Zill O.A., et al. Analytical and clinical validation of a digital sequencing panel for quantitative, highly accurate evaluation of cell-free circulating tumor DNA. PLoS One. 2015;10(10):e0140712. doi: 10.1371/journal.pone.0140712.
30. Plagnol V., Woodhouse S., Howarth K., et al. Analytical validation of a next generation sequencing liquid biopsy assay for high sensitivity broad molecular profiling. PLoS One. 2018;13(3):e0193802. doi: 10.1371/journal. pone.0193802.
31. Foundation Medicine, Inc. Foundation Medicine Web site. https:// www.foundationmedicine.com/genomic-testing/foundation-one-liquid.Accessed March 18, 2019.
32. Oncomine™ lung cfDNA assay. Thermo Fisher Scientific Web site.https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A31149. Accessed

March 18, 2019.