Фрагментный анализ

Электрофорез фрагментов ДНК обеспечивает разделение этих фрагментов при их распределении в агарозном или полиакриламиднм геле. Фрагменты ДНК движутся в геле, помещенном в постоянное электрическое поле, от отрицательного полюса к положительному в зависимости от размеров (чем больше относительная молекулярная масса фрагмента, тем медленнее он движется в электрическом поле). После окончания электрофореза каждый фрагмент ДНК занимает определенное положение в виде дискретной полосы в конкретном месте геля. Длину каждого фрагмента можно определить путем сравнения пройденного фрагментом расстояния с расстоянием, пройденным стандартным образцом ДНК с известными размерами.

Электрофорез ДНК в геле

Визуализация и идентификация фрагментов ДНК в геле становятся либо конечным этапом диагностики, либо элементом дальнейшего анализа.

Визуализация фрагментов ДНК после ПЦР осуществляется сравнительно легко. После окончания ПЦР проводят электрофорез в агарозном геле, после чего гель обрабатывают этидия бромидом, который связывается с ДНК. При ультрафиолетовом облучении поверхности геля выявляется свечение в красной области спектра.

Разработаны и другие методы окраски ПЦР-фрагментов. В некоторых вариантах методов возможна автоматическая регистрация результатов.

Идентификацию конкретных фрагментов в геле среди геномной ДНК провести труднее. Из-за больших размеров генома человека после рестрикции образуется так много рестриктных фрагментов, что агарозный гель после электрофореза и окраски этидия бромидом в ультрафиолетовых лучах выглядит более или менее равномерно окрашенным.

Рестрикционный анализ

Рестрикция ДНК на фрагменты, необходимый этап молекулярно-генетической диагностики, осуществляется рестриктазами, относящимися к группе бактериальных эндонуклеаз. В генетике человека используют несколько десятков разных рестриктаз. Они способны разрывать двухцепочечную ДНК в пределах строго определенных для каждого фрагмента последовательностей нуклеотидов протяженностью 4-6 пар оснований (редко больше). При обработке геномной ДНК рестриктазой получается закономерный для данного фермента набор фрагментов различной длины.

STR анализ

Короткий тандемный повтор (буквальный перевод англ. short tandem repeat, STR) — повтор двух или более пар непосредственно примыкающих друг к другу нуклеотидов в последовательности ДНК. Например, в локусе DYS391 может быть 12 повторов из четырех нуклеотидов ... TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA ... Такое количество повторов можно записать как DYS391=12. Количество STR-маркеров составляет около 10 000 и они применяются как правило для анализа родственных отношений или же для идетнификации личности по ДНК. Анализируя небольшое количество разных типов повторов (называемых ДНК-маркерами) в генотипе человека можно получить его уникальный генетический профиль, который используется для анализа в целях установления родства. В настоящее время установление отцовства и других видов родства в основном проводят по 16 аутосомным STR-маркерам, но уже существуют системы с большим количеством ДНК-маркеров.

Анализ микросателлитных маркеров (STR)

MLPA

Метод, позволяющий определять наличие дополнительныхкопий (до 50) разных геномных ДНК или РНК последовательностей, который также может обнаружить последовательности, отличающиеся всего одним нуклеотидом.

Предлагаемая нами диагностика, основанная на полимеразной цепной реакции с детекцией на капиллярном электрофорезе, способна преодолеть указанные недостатки. Анализ обеспечивает выявление премутации путем точного определения размеров аллелей до 200 повторов CGG и идентификацию полномутационных аллелей CGG как у мужчин, так и у женщин, идентифицировать AGG перерывы. Это позволяет использовать такой диагностический тест при определении синдрома ломкой хромосомы X и всех типов связанных с нею расстройств, таких как: тремор-атаксический синдром (FX-TAS) и первичная недостаточность яичников (FX-POI), а также выявлять риск экспансии повторов до полной мутации в следующем поколении у пациентов с премутацией, что дает возможность информировать родителей о вероятности возникновения синдрома ломкой Х хромосомы у детей.